ELISA試劑盒Hanks、D-Hanks液和消化液(胰酶液)的配制
一、 實驗目的
熟練掌握Hanks、D-Hanks液等平衡鹽溶液的配制，了解消化液(胰酶液)的配制方法。
二、實驗原理
Hanks液是常見的平衡鹽溶液(BSS)之一。D-Hanks液則是無鈣鎂離子的Hanks液。BSS與細胞生長狀態(tài)下的pH值、滲透壓及無菌狀態(tài)一致，且配方簡單，是組織培養(yǎng)基本用液，常用于配制培養(yǎng)基及其他用液，或洗細胞等，細胞在BSS中可生存幾個小時。胰蛋白酶(胰酸)溶液是一種常用的細胞消化液，原代培養(yǎng)時用于處理組織塊，使細胞分離下來。傳代時用胰蛋白酶使培養(yǎng)細胞離開所貼附的培養(yǎng)瓶表面，并分散成單個細胞。胰蛋白酶主要采自?；蜇i的胰臟，呈白色粉末狀，易潮解，應在低溫干燥處保存。胰酶的活力常用一份胰酶解離酪蛋白的份數(shù)表示，常用胰酶活力為1：125或1：250。本實驗室一般用1：250(GRC公司)。胰蛋白酶對細胞的分離效果與細胞的類型、特性和瓶壁表面特性有關。一般來說濃度大、溫度高(勿高于37℃)、作用時間長，則對細胞分離能力大。但超過一定程度會損傷細胞，導致細胞傳代后不能貼壁或死亡。胰酶在pH 8.0、37℃時消化能力zui強。溶液中的Ca2+、Mg2+和血清會降低胰酶活力，所以配制胰酶時須用無Ca2+、Mg2+的D-Hanks液。當消化結束時，可加入少量血清或含血清的培養(yǎng)基以終止胰酶作用。細胞傳代使用的胰酶濃度是0.25%或0.2%。用于原代細胞培養(yǎng)消化組織塊則為0.1%或0.125%。
三、儀器、試劑和材料
材料：3 000 mL錐形瓶，25 mL、50 mL試劑瓶，500 mL輸液瓶，螺口蓋，翻帽塞，pH試紙，孔徑0.22μm的微孔濾膜。
試劑：NaCl，Na2HP04，KH2P04，KCl，酚紅，NaHC03，胰蛋白酶干粉，0.02%EDTA，CaCl2，D-葡萄糖，MgCh·6H20，MgS04·7H20，酚紅(0.1%)(配法：稱酚紅2 g，置于研磨器中，先用數(shù)滴5.6%的NaHCO3溶液溶解并研磨，再加進該5.6%NaHC03溶液使zui終體積為100 mL。瓶裝保存，備用)。
儀器： 抽濾泵1套，過濾器1套，高壓滅菌鍋，量筒，磁力攪拌器，研磨器。
四、實驗步驟
(一)配制D-Hanks液
1.按表2—3—5稱取D-Hanks試劑。
2.依次加入上述試劑至800 mL蒸餾水中，溶解后定容至1 1000 mL。 3.高壓滅菌，10磅10 min。
(二)配制Hanks液
1.按表2—3—5稱取Hanks試劑。
2.稱取一定量胰蛋白酶粉末于研磨器中(夏天時研磨器應放在冰浴中)，加入少量D-Hanks液研磨1 000次左右，調制成糊狀。再放入4℃預冷的適量D-Hanks液中，4℃下磁力攪拌使*溶解。
3.用NaHC03干粉將胰酶溶液的pH值調至8.0左右(胰酶作用的zui適pH值)，并加入0.02%EDTA以協(xié)助消化作用。
4.濾過除菌(方法見二、培養(yǎng)基的配制)，-20℃凍存。
五、注意事項
1.BSS的pH值應確定為7.2左右。
2.如配制的Hanks液高壓滅菌后液體變混，則可將100 mL的CaCl2與含有其他成分的液體分別裝瓶高壓滅菌之后，再在無菌條件下配制，定容。這樣可以避免高壓滅菌后液體變混。
3.胰酶受熱易失活，所以盡量避免盛夏配制，并且在配制過程中溫度應始終保持在4℃左右。
4.胰酶研磨要充分，否則在過濾時會將較大的顆粒過濾掉，不能達到真正的濃度。
5.胰酶分裝時盡量分裝成多瓶，并遵守3次左右用完和只裝2/3體積的原則。因為冷凍保存時體積會膨脹，而多次使用同一瓶胰酶反復凍融會降低消化效果并可能造成污染。
Ⅳ、傳代細胞培養(yǎng)與觀察
一、實驗目的
熟練傳代細胞的傳代方法及操作過程。
二、實驗原理
傳代培養(yǎng)是指細胞從一個培養(yǎng)瓶以1：2或1：2以上的比例轉移，接種到另一培養(yǎng)瓶的培養(yǎng)。
細胞培養(yǎng)是一種操作繁瑣而又要求十分嚴謹?shù)膶嶒灱夹g。要使細胞能在體外長期生長，必須滿足兩個基本要求：一是供給細胞存活所必需的條件，如適量的水、無機鹽、氨基酸、維生素、葡萄糖及其有關的生長因子、氧氣、適宜的溫度，ELISA試劑盒注意外環(huán)境酸堿度和滲透壓的調節(jié)。二是嚴格控制無菌條件。
三、儀器、材料和試劑
儀器：CO2培養(yǎng)箱、倒置顯微鏡、超凈臺
材料：培養(yǎng)瓶、試管、移液管、巴士德吸管、廢液缸、75%酒精棉球、酒精燈、培養(yǎng)的細胞。
試劑：培養(yǎng)基RPMI1640、小牛血清、0.25%胰蛋白酶、Hanks液。
四、實驗步驟
1、入無菌室之前用肥皂洗手，再用75% 的酒精擦拭消毒雙手;
2、倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)，確定細胞是否傳代及細胞需要稀釋的倍數(shù)。 將培養(yǎng)用液37℃下預熱。
3、超凈臺臺面應整潔，用75%酒精棉球擦拭清潔;
4、打開超凈工作臺的紫外燈照射臺面20min左右，關閉紫外燈，打開風機清潔空氣出去臭氧;
5、點燃酒精燈;取出無菌試管，巴士德吸管和刻度吸管;安上橡皮頭;過酒精燈火焰略燒后插在無菌試管內。
6、將培養(yǎng)用液瓶口用75%酒精消毒，過酒精燈火焰后斜置于酒精燈旁的架子上。
7、倒掉培養(yǎng)細胞的舊培養(yǎng)基。酌情可用2-3ml Hanks液洗去殘留的就培養(yǎng)基，或用少量胰酶涮洗一下。
8、每個大培養(yǎng)瓶加入1ml胰酶，小培養(yǎng)瓶用量酌減，蓋好瓶蓋后在倒置顯微鏡下觀察。當細胞收回突起變圓時立即翻轉培養(yǎng)瓶，使細胞脫離胰酶，然后將胰酶倒掉。注意勿使細胞提早脫落入消化液中。
9、加入少量的含血清的新鮮培養(yǎng)基，反復吹打消化好的細胞使其脫壁并分散，再根據(jù)分傳瓶數(shù)補加一定量的含血清的新鮮培養(yǎng)基(7-10ml/大瓶;3-5ml/小瓶)制成細胞懸液，然后分裝到新培養(yǎng)瓶中。蓋好瓶蓋，適度擰緊后稍回轉，以利于CO2的進入，將培養(yǎng)瓶放回CO2培養(yǎng)箱。
10、對懸浮培養(yǎng)細胞，步驟7-9不做。直接將細胞懸液進行離心去除舊培養(yǎng)基上清，加入新鮮培養(yǎng)基，然后分裝到各瓶中。
五、注意事項
1、傳代培養(yǎng)時注意無菌操作并防止細胞間的交叉污染。所有操作盡量靠近酒精燈火焰。每次只進行一種細胞的操作。每種細胞使用一套器材。
2、每天觀察細胞形態(tài)，掌握好細胞是否健康的標準：健康細胞的形態(tài)飽滿，折光性好，生長致密時即可傳代。
3、如發(fā)現(xiàn)細胞有污染跡象，應立即采取措施，一般應棄置污染的細胞，如果必須挽救，可加含有抗生素的BBS或培養(yǎng)基反復清洗，隨后培養(yǎng)基中加入較大量的抗生素，并經(jīng)常更換培養(yǎng)基。
Ⅴ、細胞的凍存與復蘇
一、 實驗目的
掌握細胞保存的方法，能獨立地進行細胞的凍存與復蘇操作。
二、實驗原理
細胞凍存是細胞保存的主要方法之一。利用凍存技術將細胞置于-196℃液氮中低溫保存，可以使細胞暫時脫離生長狀態(tài)而將其細胞特性保存起來，這樣在需要的時候再復蘇細胞用于實驗。而且適度地保存一定量的細胞，可以防止因正在培養(yǎng)的細胞被污染或其他意外事件而使細胞丟種，起到保種的作用。此外，還可以利用細胞凍存的形式購買、寄贈、交換和運送某些細胞。
細胞凍存時向培養(yǎng)基中加入保護劑——終濃度5%-15% 的甘油或二甲基亞砜(DMSO)，可使溶液冰點降低，加之在緩慢凍結條件下，在細胞內水分透出，減少了冰晶形成，從而避免細胞損傷。
采用“慢凍快融"的方法能較好的保證細胞的存活。標準冷凍速度為-1~-2℃/min，當溫度低于-25℃時加速，到-80℃之后直接投入液氮內(-196℃)。復蘇細胞時則直接將裝有細胞的凍存管投入40℃熱水中迅速解凍。
三、儀器、試劑和材料
儀器：4℃冰箱、-70℃冰箱、液氮容器、微量加樣器、水浴鍋、離心機。
材料：凍存管、細胞培養(yǎng)用材料、500ml燒杯、膠布、搪瓷杯、75%酒精棉球。
試劑：培養(yǎng)基RPMI1640、小牛血清、0.25%胰蛋白酶溶液、二甲基亞砜(DMSO)或甘油、0.5%臺盼籃染液、液氮。
四、實驗步驟
(一)細胞凍存
1、取待凍存的細胞用胰酶消化，用培養(yǎng)基將細胞沖洗下來。800r/min離心5min，棄上清收集細胞。如果是懸浮培養(yǎng)的細胞，可直接離心收集細胞。
2、加入適量凍存液(10%甘油+90%培養(yǎng)基，或是10%DMSO+90%培養(yǎng)基)制成細胞懸液。細胞濃度宜大，3*106個/ml左右，并可適量增加小牛血清濃度至20%。
3、細胞懸液裝入凍存管中。用膠布封裹，做好標記(注明細胞種類、時間、條件等)。
4、凍存管在4℃下存放30min，轉放-20℃1.5h~2h，再轉入-70℃4~12h后即可轉入液氮內(-196℃)，注意進行登記。
(二)細胞復蘇
1、取一搪瓷杯盛上適量自來水加熱至40℃左右。
2、從液氮中取出凍存管立即投入40℃水中迅速解凍。
3、取出凍存管，用75%酒精清潔管口，打開。
4、離心去上清收集細胞，用無血清培養(yǎng)基洗1次，加入3ml新鮮培養(yǎng)基，于小培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。
5、每日觀察細胞生長情況，ELISA試劑盒如果死細胞較多，復蘇次日應換液。待細胞長滿后進行傳代培養(yǎng)。
五、注意事項
1、在使用含有DMSO的凍存液時，因為DMSO在室溫狀態(tài)易損傷細胞，所以在細胞加入凍存液后應盡快放入4℃環(huán)境中。
2、準確記錄細胞的種類、凍存時間、凍存液的品種和凍存者信息。
小結：這里總結了動物細胞培養(yǎng)的從器材消毒、試劑配制、細胞的凍存復蘇操作技術，希望對大家有用。
